Un film moléculaire capture la réparation de l’ADN du début à la fin
Une équipe internationale de chercheurs a utilisé la cristallographie ultrarapide résolue en temps pour suivre les progrès de la réparation de l’ADN par une enzyme photolyase. Ce travail constitue «la première caractérisation structurale d’un cycle complet de réaction enzymatique», explique Manuel Maestre-Reyna, qui a dirigé la recherche.
Bien que de nombreuses étapes de ce processus aient déjà été étudiées, la nouvelle recherche va beaucoup plus loin « en visualisant la chorégraphie du substrat et de l’enzyme », explique le biologiste moléculaire Aziz Sancar de la faculté de médecine de l’Université de Caroline du Nord, qui a reçu le prix le prix Nobel de chimie 2015 pour ses travaux sur les études mécanistiques de la réparation de l’ADN. En particulier, l’étude a surmonté le défi consistant à capturer des événements qui se produisent à des échelles de temps très différentes afin de cartographier chaque étape enzymatique du processus. Sancar le qualifie de « travail exceptionnel, repoussant les limites de la cristallographie résolue dans le temps ».
« Les enzymes sont lentes »
Les photolyases réparent les dommages à l’ADN causés par la lumière ultraviolette chez les bactéries, les champignons, les plantes et certains animaux, notamment les marsupiaux. Les humains et les autres mammifères ne contiennent pas ces enzymes, mais nous subissons également des dommages induits par la lumière. Un résultat courant est la formation de dimères de cyclobutane-pyrimidine (CPD), dans lesquels deux bases pyrimidine adjacentes (thymine ou cytosine) fusionnent via un cycle cyclobutane à quatre chaînons. «La formation de CPD est la principale cause de cancer de la peau, et la peau brûlée par le soleil contient toujours des lésions de CPD», explique Maestre-Reyna, biochimiste à l’Institut de chimie biologique de Taipei, à Taiwan.
L’enzyme répare l’ADN en maintenant le CPD dans son site actif, tandis qu’un coenzyme flavine adénine dinucléotide (FAD) transfère un électron au cycle cyclobutane dans un processus lui-même stimulé par la lumière. Cela déclenche une réaction radicalaire qui coupe les deux liaisons carbone-carbone qui maintiennent les pyrimidines ensemble.
Tout cela se produit rapidement une fois que FAD est activé : le transfert d’électrons initial se produit après 100 ps, et la deuxième liaison C-C se rompt après environ 1 ns. Mais il faut ensuite environ 500 ns pour que le site actif de l’enzyme revienne à son état initial, et 200 µs supplémentaires pour que les pyrimidines réparées sortent du site actif et que l’ADN soit libéré.
« Les enzymes sont lentes », explique le biophysicien Marius Schmidt de l’université du Wisconsin-Milwaukee. «Les cycles catalytiques se terminent à l’échelle de la milliseconde, mais les événements fondamentaux tels que la formation de liaisons et les relaxations locales sont extrêmement rapides.» Ces deux échelles de temps sont difficiles à concilier.
Pour suivre l’ensemble du processus, Maestre-Reyna et ses collègues ont réalisé une cristallographie ultrarapide sur des co-cristaux d’une photolyase microbienne et d’un ADN contenant du CPD, en utilisant deux sources laser à électrons libres (FEL) de rayons X brillants. Une équipe, travaillant en Suisse, a collecté des données pour les 10 premières ns de la réaction, tandis que l’autre équipe, utilisant un FEL au Japon, a étudié la relaxation du complexe enzymatique et la libération de l’ADN de 10 ns à 200 μs.
Nous avons dû purifier la protéine, l’activer, la co-cristalliser, récolter les cristaux et collecter les données dans un délai de 20 heures.
Le principal défi, explique Maestre-Reyna, était que les équipes devaient travailler rapidement pour collecter les données. «Les photolyases ne sont actives que sous leur forme entièrement réduite, c’est pourquoi toutes les expériences ont dû être réalisées dans des conditions sans oxygène», explique-t-il. Et comme la forme réduite s’oxyde si facilement, ils ont estimé qu’il ne leur restait qu’une vingtaine d’heures avant qu’elle ne soit à nouveau désactivée. «Nous avons dû purifier la protéine, l’activer, la co-cristalliser, récolter les cristaux et les préparer pour la collecte de données, puis collecter les données, le tout sur place en 20 heures maximum», ajoute-t-il.
Maestre-Reyna souligne que le travail n’a été possible qu’avec une grande équipe multidisciplinaire. Parmi eux, Ming-Daw Tsai du laboratoire de Taiwan qui a beaucoup travaillé sur les bases structurelles de la réparation de l’ADN, Lars-Oliver Essen de l’Université Philipps de Marburg (« l’un des plus importants scientifiques de la photolyase au monde »), Junpei Yamamoto de l’Université d’Osaka. (« peut-être le seul chimiste de synthèse au monde capable de produire de l’ADN photoendommagé aux énormes échelles requises »), et Antoine Royant de l’Université de Grenoble Alpes, expert en exécution spectroscopie dans les cristaux.
Un composant clé, mais jusqu’ici peu compris, de la réaction est un groupe de cinq molécules d’eau au sein du site actif. Ce cluster, lié à l’hydrogène à une partie de la protéine, semble affiner l’affinité du site actif pour les CPD et lui permet de se réorganiser rapidement lorsque le transfert d’électrons initial se produit – une idée auparavant spéculative que confirment les nouveaux travaux. Maestre-Reyna dit également que « même si nous sommes arrivés armés d’une très bonne connaissance de ce à quoi nous attendre au cours de la première nanoseconde environ, ce qui se passerait plus tard (lorsque les bases seraient libérées) était un territoire très inexploré ».